抗氧化研究

 蓝莓花青素的抗氧化作用和抑菌性研究：

 以测定蓝莓花青素对超氧阴离子自由基、羟基自由基 (·OH) 、DPPH自由基 (DPPH·) 的清除能力来评价蓝莓花青素的抗氧化能力, 通过对E.coli的抑制作用评价其抑菌性。结果显示, 蓝莓花青素对超氧阴离子自由基、羟基自由基及DPPH自由基清除率随着蓝莓花青素浓度的增大而提高, 并且其抗氧化能力高于等浓度的抗坏血酸;蓝莓花青素可有效抑制E.coli的生长。所以, 蓝莓花青素具有很高的抗氧化活性和一定的抑菌作用。

 花青素又称花色素, 是一类水溶性天然色素, 属黄酮类化合物, 多以糖苷形式存在, 结构单元为α-苯基苯并吡喃型阳离子。蓝莓又名越橘, 为杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木, 品种丰富, 富含花青素。本试验采用花青素含量高的野生种蓝莓鲜果。目前, 国内外对蓝莓花青素已有多项研究, 常规提取工艺已经建立。本研究在蓝莓花青素高效提取的基础上, 深入探明其抗氧化能力和抗菌能力, 以加速蓝莓花青素的市场开发。

1.1 仪器设备

 野生种蓝莓果采自芬兰 -拉普兰德地区。紫外-可见分光光度计、电热恒温水浴锅、电热鼓风、干燥箱超净工作台。

1.2 蓝莓花青素制剂

 蓝莓花青素制剂由本实验室制备。主要工艺流程如下:取蓝莓鲜果破碎后用乙醇浸提, 过滤后离心得花青素提取液, 经聚酰胺树脂吸附, 用60%乙醇洗脱后旋蒸得到花青素纯化液, 再低温真空干燥得蓝莓花青素冻干粉。最后用超纯水配制成100mg/ml的蓝莓花青素制剂。

1.3 实验方法

1.3.1 蓝莓花青素抗氧化活性的测定

1.3.1. 1 超氧阴离子自由基清除能力的测定

 25℃水浴中放置4.5ml 50m M p H 8.2的Tris-HCl缓冲液20min, 加入1ml 100mg/ml的蓝莓花青素制剂样品和0.5ml 25m M邻苯三酚溶液, 混匀并在25℃水浴中静置5min后加入1ml8M HCl终止反应。以Tris-HCl Buffer作为参比, 空白对照组为双蒸水, 对照组为等浓度的抗坏血酸溶液。每个试验重复三次, 425nm处测定其吸光度A, 取平均值用以计算清除率。

1.3.1. 2 羟基自由基 (·OH) 清除能力的测定

 取1ml 9m M Fe SO₄、1ml 9m M水杨酸的乙醇溶液、1ml蓝莓花青素样品, 加入1ml 8.8m M H₂O₂, 37℃水浴静置30min。以蒸馏水为参比, 空白对照组为双蒸水, 对照组为等浓度的抗坏血酸溶液。每个试验重复三次, 510nm处测定其吸光度A, 取平均值用以计算清除率。

1.3.1. 3 DPPH自由基 (DPPH·) 清除能力的测定

 用无水乙醇配制0.04mg/ml DPPH·溶液, 避光保存。2ml DPPH·溶液与2ml蓝莓花青素样品充分混合, 静置30min。空白对照组为双蒸水, 对照组为等浓度的抗坏血酸溶液。每个试验重复三次, 515nm处测定其吸光度A, 取平均值用以计算清除率。

1.3.2 蓝莓花青素抑菌活性的测定

1.3.2. 1 E.coli生长曲线的绘制

 配置1.25mg/ml蓝莓花青素菌液, 且含菌数为10³-10⁵个/ml, 37°C震荡培养, 每小时取样测A₅₃₂, 绘制E.coli生长曲线。

1.3.2. 2 蓝莓花青素对E.coli敏感性的测试

 分别于1.5ml EP管中加入0、12.5、25、50μl蓝莓花青素样品, 加入5μl E.coli, LB培养基补至lml。37°C震荡培养1.5h, 取100μl菌液接种至LB固体培养基。37°C恒温培养12h。采用液体倍比稀释法测定MIC (最低抑菌浓度) 和MBC (最低杀菌浓度) 。每个处理重复3次。

2.1 蓝莓花青素的抗氧化活性

 蓝莓花青素抗氧化活性的测定方法有多种,本次实验研究通过测定超氧阴离子自由基的清除能力、羟基自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力来确定蓝莓花青素的抗氧化能力。

2.1.1 对超氧阴离子自由基的清除作用

图1 蓝莓花青素、抗坏血酸清除超氧阴离子自由基的能力比较 

 蓝莓花青素清除超氧阴离子自由基的能力显著, 且随着制剂浓度的增加, 其清除作用不断增强。当浓度达0.3mg/ml时, 其清除率达80%。

2.1.2 对羟基自由基的清除作用

图2 蓝莓花青素和抗坏血酸对·OH的清除能力比较

 蓝莓花青素清除羟基自由基的清除率, 蓝莓花青素清除·OH的能力高于抗坏血酸。

2.1.3 对DPPH自由基的清除作用

图3 蓝莓花青素和抗坏血酸对DPPH·的清除能力比较

 蓝莓花青素对DPPH自由基清除作用显著, 且其清除率在制剂浓度高于0.005mg/ml时高于抗坏血酸。而在药物浓度低于0.005mg/ml时低于抗坏血酸。

2.2 蓝莓花青素对E.coli生长曲线的影响

图4 蓝莓花青素对E.coli生长曲线的影响

 在3-8h为E.coli的正常对数生长期, 在含有1.25mg/ml蓝莓花青素的LB中, E.coli生长曲线变化明显:在蓝莓花青素制剂作用4h后, 菌体数目下降, 6h后很快进入衰亡期, 没有达到正常的生长高峰。这表明, 蓝莓花青素主要抑制了E.coli对数生长期的菌体分裂。

2.3 蓝莓花青素对E.coli生长的抑制作用

图5 蓝莓花青素对E.coli生长的抑制作用

 蓝莓花青素对E.coli的生长有明显的抑制作用, 且随着蓝莓花青素浓度增加, 抑菌效果显著增加。当蓝莓花青素样品浓度达5mg/ml时, 未检测到E.coli菌落的出现, 对E.coli生长的抑制率为100%。液体倍比稀释法测得蓝莓花青素对E.coli的MIC及MBC为0.734 (mg/ml) 和1.36 (mg/ml) 。

 蓝莓花青素清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基的能力显著高于等浓度的抗坏血酸, 其清除率随其浓度增加而提高, 且对E.coli生长具有较好的抑制作用, 可以作为天然抗氧化剂在食品工业中进行开发应用。